2. CHUYÊN ĐỀ 2: ĐỘT BIẾN GEN VÀ NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN PHÂN TỬ
2.1 Khái niệm Gen và Phân loại Đột biến Gen
Cấu trúc Gen mã hóa Protein:
Gen: Đoạn ADN mang thông tin di truyền mã hóa cho một phân tử ARN có chức năng hoặc một chuỗi polypeptid.
Exon: Các đoạn trình tự gen được giữ lại trong mARN trưởng thành sau phản ứng cắt nối.
Intron (IVS - Intervening sequence): Trình tự không mã hóa nằm giữa các exon. Vùng ranh giới intron luôn tuân theo quy tắc: Bắt đầu bằng GT (5' donor site) và kết thúc bằng AG (3' acceptor site).
Codon: Bộ ba nucleotide trên mARN mã hóa acid amin.
Phân loại Biến thể Gen theo Tiêu chuẩn Lâm sàng (ACMG / AMP):
Lành tính (Benign)
Có thể lành tính (Likely benign)
Biến thể chưa rõ ý nghĩa (VUS - Variant of Uncertain Significance)
Có thể gây bệnh (Likely pathogenic)
Gây bệnh (Pathogenic)
Phân loại Đột biến theo Cấu trúc Nucleotide:
Mất nucleotide (Deletion):
In-frame deletion: Mất bội số của 3 nucleotide, làm mất một hoặc nhiều acid amin nhưng không làm thay đổi khung đọc downstream.
Frameshift deletion: Mất số nucleotide không chia hết cho 3, làm dịch chuyển hoàn toàn khung đọc mã di truyền từ vị trí đột biến, dẫn đến chuỗi acid amin sai lệch và thường tạo codon kết thúc sớm.
Thêm nucleotide (Insertion): Tương tự gồm In-frame insertion và Frameshift insertion. Một dạng đặc biệt là Lặp đoạn nội tại (ITD - Internal Tandem Duplication).
Thay thế nucleotide (Substitution):
Đồng nghĩa / Im lặng (Synonymous / Silent): Thay thế base nhưng không thay đổi acid amin mã hóa.
Sai nghĩa (Missense): Thay thế base làm biến đổi acid amin tương ứng tại vị trí đó.
Vô nghĩa (Nonsense): Thay thế base tạo nên codon kết thúc sớm (UAA, UAG, UGA), làm ngắt quãng ngắn chuỗi polypeptid.
Phân loại Đột biến theo Chức năng Protein:
Đột biến mất chức năng (Loss-of-function): Làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính sinh học của protein. Phổ đột biến thường phân tán rộng khắp chiều dài của gen.
Đột biến thêm chức năng (Gain-of-function): Làm tăng mạnh hoạt tính hoặc tạo nên chức năng sinh học mới bất thường cho protein. Đột biến thường tập trung tại các vị trí điểm nóng ("hotspot").
2.2 Danh pháp Đột biến Gen (Tiêu chuẩn Quốc tế HGVS)
Danh pháp HGVS
Ý nghĩa Cấu trúc Nucleotide / Protein
Tác động Chức năng & Bệnh lý Liên quan
c.218T>C
Thay T thành C ở nucleotide 218 trên cDNA
Đột biến sai nghĩa p.Ile73Thr gen SFTPC gây bệnh phổi mô kẽ ở trẻ em.
c.79G>A
Thay G thành A ở nucleotide 79 trên cDNA
Đột biến sai nghĩa p.Glu27Lys (p.E27K) gen HBB tạo nên Hemoglobin E (HbE).
p.E746_A750del
Mất 5 acid amin từ Glutamate 746 đến Alanine 750
Đột biến mất đoạn in-frame exon 19 gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ.
IVS2+1G>T
Thay G thành T tại vị trí +1 donor site của Intron 2
Rối loạn cắt nối mARN nghiêm trọng trong bệnh \beta-Thalassemia.
c.5335delC
Mất nucleotide Cytosine tại vị trí 5335
Đột biến lệch khung đọc (p.Q1779Nfs*14) gen BRCA1 gây ung thư vú/buồng trứng.
c.1824C>T
Thay C thành T tại nucleotide 1824 trên exon 11 gen LMNA
Đột biến đồng nghĩa (p.G608G): Kích hoạt một vị trí cắt nối giả mới (cryptic splice donor site) làm mất 50 acid amin, gây tích tụ Progerin trong Hội chứng Lão hóa sớm Hutchinson-Gilford Progeria.
2.3 Các Kỹ thuật Phát hiện Đột biến Gen
PCR đơn thuần (Polymerase Chain Reaction):
Nguyên lý: Khuếch đại nhân bản đoạn ADN đích in vitro qua 3 bước chu kỳ nhiệt: Biến tính (94-95^\circ\text{C}), Bắt cặp mồi (55-65^\circ\text{C}), Kéo dài (72^\circ\text{C}).
Nhược điểm lâm sàng chính: Chỉ khuếch đại được các sản phẩm ngắn (<2\text{ kb}); enzym Taq Polymerase thông thường thiếu hoạt tính đọc sửa (3'\rightarrow5' proofreading) nên có tỷ lệ sai sót (infidelity), đòi hỏi phải dùng enzym sửa sai độ trung thực cao (high-fidelity DNA polymerase) khi chuẩn bị mẫu giải trình tự.
ASO-PCR (Allele-Specific Oligonucleotide PCR):
Nguyên lý: Thiết kế mồi đặc hiệu alen với đầu 3' khớp chính xác tuyệt đối với nucleotide đột biến hoặc kiểu dại. Phản ứng khuếch đại chỉ xảy ra khi có mặt alen tương ứng.
Ứng dụng: Chẩn đoán nhanh các đột biến điểm đã biết trước, điển hình như đột biến JAK2 V617F trong bệnh lý tăng sinh tủy.
GAP-PCR:
Nguyên lý: Sử dụng các cặp mồi nằm ở hai phía ngoài vùng bị mất đoạn lớn. Nếu có mất đoạn xảy ra, khoảng cách giữa các mồi thu ngắn lại cho phép enzym khuếch đại tạo ra băng sản phẩm PCR kích thước đặc trưng.
Ứng dụng: Chẩn đoán mất đoạn lớn gen globin trong \alpha-Thalassemia (-\alpha^{3.7}, -\alpha^{4.2}, --^{\text{SEA}}).
Giải trình tự Chuỗi ADN Sanger (Sanger DNA Sequencing):
Nguyên lý: Phản ứng tổng hợp ADN sử dụng các dideoxynucleotide (ddNTP) gắn phẩm màu huỳnh quang gây ngắt chuỗi ngẫu nhiên.
Ứng dụng: Tiêu chuẩn vàng để xác định các đột biến điểm, đột biến nhỏ (cả biến thể mới và đã biết) trên đoạn gen <1\text{ kb}. Độ nhạy giới hạn: chỉ phát hiện được các dòng đột biến chiếm tỷ lệ \ge10-20\% trong mẫu bệnh phẩm.
Giải trình tự Thế hệ mới (NGS - Next-Generation Sequencing):
Nguyên lý: Giải trình tự song song hàng triệu đoạn ADN nhỏ trên mảng dòng chảy (flowcell) bằng tín hiệu huỳnh quang thời gian thực.
Ưu điểm: Tầm soát đồng thời hàng trăm gen hoặc toàn bộ vùng mã hóa (WES)/toàn bộ bộ gen (WGS); độ nhạy cực cao (phát hiện dòng đột biến có tần suất thấp đến 1\%), cho phép định lượng động học dòng đột biến kháng thuốc và phân tích đơn dòng.
2.4 Ứng dụng Lâm sàng và Các Lưu ý về Đột biến Gen
[ Bệnh nhân Huyết khối Tĩnh mạch Sâu (DVT) vô căn người Việt ]
|
+----------------+----------------+
| |
[ Chỉ định Xét nghiệm Lâm sàng ] [ Không Chỉ định ]
| |
v v
Tầm soát Đột biến Gen: Yếu tố V Leiden (c.1691G>A)
- PROC (Đặc biệt c.565C>T / p.R189W) (Tần suất alen ở VN = 0%)
- PROS1
Phân định biến thể gen mới và vai trò tư vấn: Việc phân loại biến thể VUS đòi hỏi tra cứu cơ sở dữ liệu bộ gen người Việt ("A Vietnamese human genetic variation database"), kết hợp công cụ sinh tin học in silico và nghiên cứu chức năng. Bác sĩ lâm sàng giữ vai trò nòng cốt trong việc chỉ định đúng đấn và tư vấn di truyền trước/sau xét nghiệm.
3. CHUYÊN ĐỀ 3: BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN TẾ BÀO
3.1 Cấu trúc, Chức năng Nhiễm Sắc Thể và Chu kỳ Phân bào
Cấu trúc Nhiễm sắc thể Người (2n = 46): Gồm 22 cặp NST thường (Autosomes) đánh số từ 1 đến 22 và 1 cặp NST giới tính (XX ở nữ, XY ở nam).
Telomere: Nắp bảo vệ ở đầu tận nhánh NST. Cấu trúc gồm các chuỗi lặp ADN giàu G-T quấn phức hợp protein Shelterin. Chức năng: Bảo vệ NST không bị dính đầu tận, đảm bảo duy trì tính nguyên vẹn cấu trúc và định vị NST trong nhân.
Centromere (Tâm động): Điểm thắt eo chính phân chia NST thành nhánh ngắn (p) và nhánh dài (q). Cấu trúc gồm hàng trăm kb ADN lặp lại \alpha-satellite, là vị trí gắn kết của protein nhân CENP-B và tạo phức hợp Kinetochore đính thoi phân bào.
Trạng thái NST trong Phân bào:
Kỳ trung gian (Interphase): NST ở dạng sợi đơn (hoặc sợi kép sau pha S) tháo xoắn duỗi dài, thực hiện chức năng biểu hiện gen và tái bản, không quan sát được hình thái dưới kính hiển vi quang học.
Kỳ giữa (Metaphase): NST co ngắn cuộn xoắn tối đa, gồm 2 chromatid chị em đính ở tâm động. Đây là giai đoạn duy nhất có thể quan sát rõ nét hình thái và lập nhiễm sắc thể đồ (Karyotype).
3.2 Bất thường Số lượng Nhiễm Sắc Thể Lâm sàng
Hội chứng Down (Trisomy 21 - 47,XX/XY,+21): Tần suất 1/700 trẻ sinh sống. 95% do phân ly không đều thuần túy ở giảm phân; 3-4% do chuyển vị Robertsonian; phần còn lại do thể khảm (Mosaicism).
Hội chứng Edwards (Trisomy 18 - 47,XX/XY,+18): Tần suất 1/3000 trẻ sinh sống, 98% sảy thai tự nhiên, trẻ sinh ra thường tử vong dưới 1 tuổi. Lâm sàng: Tai thấp, bàn tay co quắp ngón chồng lên nhau, khiếm khuyết tim nặng.
Rối loạn gen: Tăng biểu hiện gen Transthyretin (TTR) trên tế bào dịch ối, gai nhau, mô gan và ruột thai nhi, làm biến đổi các yếu tố sao mã hạ nguồn.
Hội chứng Patau (Trisomy 13 - 47,XX/XY,+13): Tần suất 1/6000 trẻ sinh sống, đa số tử vong trong vòng 1 tháng sau sinh. Biểu hiện: Sứt môi, hở hàm ếch, dị tật não thất duy nhất (Holoprosencephaly), thừa ngón, dị tật thận và tim.
Hội chứng Klinefelter (47,XXY): Tần suất 1/500-1/1000 nam giới. Biểu hiện: Vô sinh, tinh hoàn nhỏ, vú to ở nam, giảm sản xuất testosterone huyết thanh nghiêm trọng.
Đa bội Nhiễm sắc thể trong Bạch cầu Cấp Dòng Lympho (B-ALL):
Đặc trưng bởi thể Đa bội cao (High Hyperdiploidy: 51-67 NST, đặc biệt có Trisomy các NST 4, 10, 17). Đem lại tiên lượng rất tốt.
3.3 Bất thường Cấu trúc Nhiễm Sắc Thể và Cách Viết Danh pháp ISCN
3.4 Các Kỹ thuật Chẩn đoán Di truyền Tế bào
Nhiễm sắc thể đồ (Karyotyping):
Yêu cầu sinh học: Bắt buộc dùng tế bào sống đang phân chia. Thu hoạch ở kỳ giữa bằng Colcemid (ức chế thoi phân bào).
Chất kích thích phân bào (Mitogens):
Lympho T máu ngoại vi: Phytohaemagglutinin (PHA).
Lympho B: TPA, Epstein-Barr Virus (EBV), Lipopolysaccharide (LPS).
Tế bào dòng tủy (Tủy xương): Sử dụng các Cytokine (IL-3, IL-6, GM-CSF).
Nhuộm băng: Băng G (G-banding) xử lý Trypsin nhuộm Giemsa phổ biến nhất (băng đậm giàu A-T; tiêu bản lưu được 2-3 năm). Băng Q (huỳnh quang DAPI/Quinacrine), Băng C (nhuộm đặc hiệu vùng tâm động).
Đánh giá: Đọc 20-30 tế bào kỳ giữa. Tầm soát toàn bộ bộ gen nhưng độ phân giải bị giới hạn (\ge10\text{ Mb}). Không phát hiện được các tái sắp xếp ẩn hoặc khuếch đại gen nhỏ.
Lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH - Fluorescence In Situ Hybridization):
Nguyên lý: Mẫu dò ADN (Probe) gắn chất huỳnh quang lai bổ sung với trình tự ADN đích trên tiêu bản tế bào.
Các loại Mẫu dò (Probe):
Centromeric \alpha-satellite probe: Đếm số lượng NST.
Whole chromosome painting probe: Nhuộm toàn bộ 1 NST.
Locus-specific / Gene probe: Nhận biết các gen đặc hiệu (Break-apart probe, Dual-fusion probe).
Ứng dụng lâm sàng: Đánh giá khuếch đại gen HER2 trong ung thư vú; mất đoạn ERG trong ung thư tiền liệt tuyến; mất đoạn TBX1 (22q11.2) trong hội chứng DiGeorge; mất đoạn TP53 (17p13); phát hiện chuyển vị BCR::ABL1 t(9;22).
Đánh giá: Thực hiện trên tế bào không phân chia (Interphase FISH), thời gian nhanh (24h), độ nhạy cao (1\%), phát hiện tái sắp xếp ẩn; tuy nhiên không tầm soát được toàn bộ bộ gen ngoài vị trí gắn probe.
Kỹ thuật CGH và Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization):
Nguyên lý: Lai so sánh cạnh tranh giữa ADN bệnh nhân (gắn huỳnh quang Cy5/màu xanh) và ADN chứng (gắn huỳnh quang Cy3/màu đỏ) trên vi mảng chứa hàng chục nghìn đoạn giếng BAC/cDNA (Array-CGH).
Ưu điểm: Phát hiện chính xác các biến đổi số lượng bản sao (CNV - Copy Number Variations) như mất đoạn, lặp đoạn nhỏ trên toàn bộ bộ gen ở độ phân giải siêu cao (<50\text{ kb}) mà không cần nuôi cấy tế bào. Hạn chế: Không phát hiện được chuyển vị cân bằng hoặc đảo đoạn cân bằng.
4. CHUYÊN ĐỀ 4: ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ HUYẾT HỌC
4.1 Rối loạn Tăng sinh Tủy (Myeloproliferative Neoplasms - MPN)
[ Tế bào CML mang gen BCR::ABL1 ]
|
+--------------------+--------------------+
| |
[ Đáp ứng với TKI ] [ Kháng Imatinib / TKI ]
| |
v v
Theo dõi định lượng RQ-PCR / dPCR Xét nghiệm Đột biến Kinase Domain
Tiêu chuẩn MMR: BCR::ABL1(IS) <= 0.1% |
+------------+------------+
| |
[ Đột biến T315I ] [ Đột biến khác ]
(Cản trở không gian) (F317L, V299L...)
| |
v v
Dùng Ponatinib / Đổi sang TKI
Dị ghép tế bào gốc Thế thế 2 phù hợp
Theo dõi Đáp ứng Điều trị CML: Sử dụng RQ-PCR hoặc dPCR (Digital PCR) định lượng tỷ lệ bản sao BCR::ABL1 theo Thang chuẩn Quốc tế (IS). Mức đáp ứng phân tử sâu (MMR / MR^3) đạt được khi BCR::ABL1^{\text{IS}} \le 0{,}1\%. Kỹ thuật dPCR chia nhỏ phản ứng thành hàng triệu giọt nano, định lượng tuyệt đối số lượng bản sao ADN/ARN không phụ thuộc đường chuẩn, đạt độ nhạy vượt trội (MR^{4.5} đến MR^5).
ĐÀO SÂU CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BCR::ABL1 T315I:
Đột biến điểm c.944C>T làm thay thế Threonine bằng Isoleucine tại vị trí 315 (p.T315I) ở vùng Kinase Domain của BCR::ABL1 (vùng cửa ngõ - Gatekeeper residue).
Cơ chế hóa - động học: Threonine 315 kiểu dại tạo một liên kết hydro quyết định với nhóm OH của Imatinib để cố định thuốc vào túi gắn ATP. Khi bị thay thế bởi Isoleucine (nhánh bên cồng kềnh kị nước), đột biến làm mất hoàn toàn liên kết hydro này, đồng thời tạo ra một sự cản trở không gian nghiêm trọng (steric hindrance). Sự cản trở này lấp kín túi đính, khiến các thuốc TKI thế hệ 1 và 2 (Imatinib, Nilotinib, Dasatinib, Bosutinib) không thể chui vào vị trí liên kết ATP.
Giải pháp: Bắt buộc dùng Ponatinib (TKI thế hệ 3 thiết kế cấu trúc vòng C-C triple bond vượt qua cản trở không gian) hoặc chỉ định dị ghép tế bào gốc. Kỹ thuật NGS được khuyến cáo để phát hiện sớm dòng đột biến T315I ở tần suất thấp (1\%).
Các Bệnh MPN BCR::ABL1(-):
Cấu trúc gen JAK2 và Đột biến JAK2 V617F: Gen JAK2 mã hóa Tyrosine Kinase gồm vùng JH1 (có hoạt tính kinase) và vùng JH2 (pseudokinase, ức chế ngược JH1). Đột biến điểm c.1849G>T (p.V617F) trên exon 14 làm mất chức năng ức chế ngược của JH2, khiến JH1 tự hoạt hóa liên tục tín hiệu hạ nguồn EPOR/STAT mà không cần Erythropoietin (EPO).
SỐ LIỆU THỰC NGHIỆM TẠI VIỆT NAM (Hoàng Anh Vũ, Phan Thị Xinh et al.): Xét nghiệm ASO-PCR ghi nhận đột biến JAK2 V617F xuất hiện với tần suất 98% ở bệnh nhân Đa hồng cầu nguyên phát (PV) (khảo sát 51 bệnh nhân) và 59% ở bệnh nhân Tăng tiểu cầu nguyên phát (ET) (khảo sát 122 bệnh nhân).
Điều trị: Thuốc ức chế JAK1/JAK2 Ruxolitinib (Jakavi) giúp giảm thể tích lách và kiểm soát triệu chứng.
Các đột biến khác: Đột biến JAK2 Exon 12; Đột biến gen CALR (Exon 9: Mất đoạn 52-bp Type 1 hoặc Thêm đoạn 5-bp Type 2 gặp ở 20-30\% ET và PMF JAK2 âm tính); Đột biến gen MPL (Exon 10: S505N, W515K/L).
4.2 Bạch cầu Cấp Dòng Tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML)
Nhóm Nguy cơ
Bất thường Nhiễm sắc thể / Đột biến Gen Đặc trưng
Tốt (Favorable)
\bullet t(8;21)(q22;q22.1) / gen tổ hợp RUNX1::RUNX1T1<br>\bullet inv(16)(p13.1q22) hoặc t(16;16) / gen tổ hợp CBFB::MYH11<br>\bullet Đột biến gen NPM1 đơn độc (không đi kèm FLT3-ITD)<br>\bullet Đột biến in-frame vùng bZIP gen CEBPA
Trung bình (Intermediate)
\bullet Đột biến NPM1 đi kèm FLT3-ITD<br>\bullet NPM1 kiểu dại đi kèm FLT3-ITD (không có bất thường xấu)<br>\bullet t(9;11)(p21.3;q23.3) / gen tổ hợp MLLT3::KMT2A<br>\bullet Nhiễm sắc thể đồ bình thường không thuộc nhóm tốt/xấu
Xấu (Adverse - Chỉ định Ghép tủy)
\bullet t(6;9)(p23;q34.1) / DEK::NUP214; t(9;22)(q34.1;q11.2) / BCR::ABL1<br>\bullet Tái sắp xếp gen KMT2A (11q23.3), gen MECOM (3q26.2)<br>\bullet Mất đoạn NST: -5, del(5q), -7, -17/abn(17p)<br>\bullet Phức tạp NST (\ge3 bất thường cấu trúc/số lượng)<br>\bullet Đột biến gen liên quan loạn sinh tủy: ASXL1, BCOR, EZH2, RUNX1, SF3B1, SRSF2, STAG2, U2AF1, ZRSR2<br>\bullet Đột biến gen TP53 (VAF \ge 10\%)
Bạch cầu Cấp Dòng Tiền Tủy (AML-M3 / APL):
Cơ chế: Chuyển vị t(15;17)(q22;q21) tạo gen tổ hợp PML::RARA. Protein hybrid này phong tỏa sự biệt hóa tế bào tủy ở giai đoạn tiền tủy bào.
Đột phá điều trị: Phác đồ nhắm trúng đích ATRA (All-trans retinoic acid - gắn vào RARA thúc đẩy tế bào biệt hóa) kết hợp Arsenic Trioxide / ATO (gắn vào PML kích hoạt chu trình chết tự nhiên Apoptosis). Sự kết hợp này tiêu diệt tận gốc dòng tế bào ác tính, giải quyết biến chứng đông máu rải rác trong lòng mạch (DIC) và chữa lành >75\% bệnh nhân.
Sự cần thiết của RQ-PCR: Định lượng bản sao PML::RARA theo thời gian để đánh giá tồn lưu tối thiểu tế bào ác tính (MRD).
AML có Nhiễm sắc thể đồ Bình thường (40-50% trường hợp): Bắt buộc giải trình tự gen NGS để phát hiện đột biến FLT3-ITD (Lặp đoạn nội tại exon 14-15 gen FLT3 - tiên lượng rất xấu, nguy cơ tái phát cực cao) hoặc đột biến NPM1 (tiên lượng tốt nếu không đi kèm FLT3-ITD).
Đột biến Khuynh hướng Dòng mầm (Germline Predisposition): Phân loại WHO/ELN cho bệnh nhân mắc AML trên nền di truyền dòng mầm đột biến các gen CEBPA, DDX41, RUNX1, GATA2, ETV6, hoặc hội chứng Fanconi.
4.3 Bạch cầu Cấp Dòng Lympho (Acute Lymphoblastic Leukemia - ALL)
4.4 U Lympho Không Hodgkin (Non-Hodgkin Lymphoma - NHL)
4.5 Bạch cầu Mạn Dòng Lympho (Chronic Lymphocytic Leukemia - CLL)
Sự Tích tụ Đột biến Phân tử theo Tiến triển Bệnh:
Diễn tiến từ Tăng lympho B đơn dòng nguy cơ thấp (MBL) \rightarrow CLL giai đoạn sớm (hiện diện del(13q14) đơn độc >50\%) \rightarrow CLL tiến triển (tích tụ đột biến NOTCH1, SF3B1, ATM, TP53) \rightarrow Hội chứng Richter (chuyển dạng u lympho tế bào B lớn độ mô học cao).
Các Dấu ấn Tiên lượng Di truyền:
del(17p13) / Đột biến gen TP53: Tiên lượng rất xấu, tế bào kháng hoàn toàn với các phác đồ hóa trị chuẩn (FCR, BR).
del(11q22) (Gen ATM): Tiên lượng nguy cơ cao.
Phức tạp nhiễm sắc thể (Complex Karyotype): \ge 3 bất thường NST không liên quan trên Karyotype, tiên lượng xấu.
Tình trạng Đột biến Gen IGHV (Immunoglobulin Heavy Chain Variable):
Unmutated IGHV (\le 2\% sai lệch so với dòng mầm): Tiên lượng xấu, bệnh tiến triển nhanh.
Mutated IGHV (> 2\% sai lệch so với dòng mầm): Tiên lượng tốt, thời gian sống còn kéo dài.
del(13q14) đơn độc: Tiên lượng tốt nhất.
Chiến lược Điều trị CLL dựa trên Dấu ấn Phân tử:
Bệnh nhân có del(17p) / đột biến TP53 hoặc IGHV không đột biến không còn chỉ định hóa trị truyền thống, mà chuyển hoàn toàn sang điều trị nhắm trúng đích phân tử: Thuốc ức chế BTK (Ibrutinib, Acalabrutinib, Zanubrutinib) hoặc Thuốc ức chế BCL2 (Venetoclax) kết hợp Obinutuzumab.
5. CHUYÊN ĐỀ 5: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG UNG THƯ
5.1 Cơ chế Phân tử của Bệnh Ung thư
\text{Biểu mô bình thường} \xrightarrow{\text{Đột biến } APC / \beta\text{-catenin}} \text{Tuyến yên nhỏ (Adenoma)} \xrightarrow{\text{Đột biến } KRAS / BRAF} \text{Tuyến yên lớn} \xrightarrow{\text{Đột biến } PIK3CA / PTEN} \text{Tuyến yên tiến triển} \xrightarrow{\text{Đột biến } TP53 / BAX} \text{Ung thư biểu mô (Carcinoma)} \xrightarrow{\text{Đột biến } SMAD4 / TGF-\beta RII} \text{Ung thư di căn}
5.2 Gen Sinh Ung (Oncogenes) và Đột biến Họ Gen RAS
Thụ thể EGFR (Hoạt động)
|
v
[ RAS - GDP ] ---------> [ RAS - GTP ] (Hoạt động)
(Bất hoạt) (GEF/GTP) |
^ v
| Kích hoạt Raf/MEK/ERK & PI3K/AKT
+-----------+
(GAP/Thủy phân GTP)
^
|
[ Đột biến KRAS Codon 12, 13, 61 ]
(Mất hoàn toàn khả năng thủy phân GTP)
|
v
[ RAS duy trì trạng thái GTP liên tục ]
(Tăng sinh độc lập hoàn toàn với EGFR)
Tác động của Đột biến Gen KRAS:
Đột biến điểm tập trung tại Codon 12, 13 và 61.
Đột biến làm mất hoàn toàn khả năng thủy phân GTP thành GDP của RAS. Kết quả là protein RAS duy trì trạng thái gắn GTP liên tục (Constitutively active). Tế bào liên tục phát tín hiệu tăng sinh qua con đường Raf/MEK/ERK và PI3K/AKT một cách độc lập hoàn toàn với thụ thể EGFR.
Ý nghĩa Dược lý Lâm sàng: Đột biến KRAS / NRAS là yếu tố kháng trị. Bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến KRAS/NRAS sẽ không có đáp ứng với các liệu pháp kháng EGFR (Cetuximab, Panitumumab).
5.3 Gen Đè nén Khối U và Vai trò của Gen TP53
Chức năng của Protein p53 ("Người bảo vệ bộ gen"):
Gen TP53 mã hóa yếu tố sao mã p53. Khi tế bào gặp tổn thương ADN, mất ổn định bộ gen hoặc thiếu oxy, p53 được kích hoạt để tạm ngưng chu kỳ tế bào tại pha G_1/S, tạo thời gian cho hệ thống tiến hành sửa chữa ADN.
Nếu tổn thương quá nặng không thể sửa chữa, p53 Kích hoạt chu trình chết tự nhiên (Apoptosis) thông qua việc tăng biểu hiện các gen hạ nguồn như PUMA, NOXA, BAX, gây giải phóng Cytochrome C từ ty thể và kích hoạt dòng thác Caspase tiêu hóa tế bào.
Phổ Đột biến TP53 trong Ung thư Người: Đột biến mất chức năng TP53 xuất hiện với tần suất cực cao trong hầu hết các loại ung thư người: Ung thư carcinosarcoma tử cung (>80\%), Ung thư buồng trứng (>70\%), Ung thư tế bào vảy ở phổi, thực quản, đầu cổ, ung thư tụy, đại trực tràng (50-70\%).
6. CHUYÊN ĐỀ 6: DƯỢC LÝ DI TRUYỀN (PHARMACOGENOMICS)
6.1 Nguyên lý Dược lý Di truyền
Khái niệm: Dược lý di truyền nghiên cứu ảnh hưởng của biến thiên di truyền cá thể đối với khả năng chuyển hóa, hiệu quả điều trị và độc tính của thuốc.
Xét nghiệm Di truyền Đồng hành (Companion Diagnostics): Là xét nghiệm di truyền bắt buộc phải thực hiện trước khi chỉ định thuốc nhắm trúng đích, nhằm chọn lọc nhóm bệnh nhân có đáp ứng hoặc loại trừ nhóm bệnh nhân nguy cơ gặp độc tính nặng.
6.2 Ứng dụng Lâm sàng trong Điều trị Nhắm Trúng Đích
Gen Mục tiêu
Dạng Biến đổi Gen
Bệnh Lý Chỉ Định
Thuốc Điều Trị Nhắm Trúng Đích
EGFR
Đột biến nhạy thuốc (Mất đoạn Exon 19, L858R Exon 21)
Ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC)
Thuốc ức chế Tyrosine Kinase (EGFR-TKI: Gefitinib, Erlotinib, Osimertinib)
KRAS / NRAS
Đột biến điểm Codon 12, 13, 61, 117, 146
Ung thư đại trực tràng di căn
Chống chỉ định Cetuximab, Panitumumab (chỉ dùng cho kiểu dại Wild-type)
BRAF
Đột biến V600E
Melanoma, Ung thư đại trực tràng
Thuốc ức chế BRAF (Vemurafenib, Dabrafenib) kết hợp MEK-TKI
KIT / PDGFRA
Đột biến Exon 9, 11, 13, 17 gen KIT
U mô đệm đường tiêu hóa (GIST)
Imatinib, Sunitinib, Regorafenib
BRCA1 / BRCA2
Đột biến dòng mầm hoặc mắc phải gây mất chức năng
Ung thư buồng trứng, Ung thư vú
Thuốc ức chế PARP (Olaparib, Niraparib, Rucaparib)
BCR::ABL1
Gen tổ hợp do chuyển vị t(9;22)
Bạch cầu mạn dòng tủy (CML)
Imatinib, Nilotinib, Dasatinib (Chuyển sang Ponatinib nếu có đột biến T315I)
7. CHUYÊN ĐỀ 7: NỘI TIẾT VÀ DI TRUYỀN
7.1 Cơ sở Di truyền trong các Bất thường Nội tiết và Chuyển hóa
Điểm số Nguy cơ Đa gen (Polygenic Risk Score - PRS): Tích hợp thông tin hàng trăm nghìn biến thể đa hình đơn nucleotide (SNP) từ các nghiên cứu GWAS để tính toán nguy cơ mắc bệnh nội tiết chuyển hóa phức tạp (Đái tháo đường typ 2, béo phì).
Bệnh Wilson (Tích tụ Đồng Di truyền):
Cơ chế: Bệnh di truyền lặn trên NST thường do đột biến gen ATP7B gây rối loạn vận chuyển và tích tụ đồng ở gan, não và các cơ quan.
Tiêu chuẩn chẩn đoán Leipzig (2001): Phối hợp vòng Kayser-Fleischer, ceruloplasmin huyết thanh, đồng trong nước tiểu/gan và phân tích đột biến gen ATP7B (đạt \ge4 điểm là chẩn đoán xác định; phát hiện đột biến trên cả 2 nhiễm sắc thể được tính 4 điểm).
Phổ đột biến gen ATP7B: Đột biến phân bố rộng trên 21 exon của gen ATP7B. Các biến thể tiêu biểu ghi nhận gồm:
Tăng Cholesterol Máu Gia đình (Familial Hypercholesterolemia): Do đột biến dòng mầm gen mã hóa thụ thể LDL (LDLR), làm suy giảm thu nhận LDL-cholesterol ở gan, gây xơ vữa động mạch sớm và nhồi máu cơ tim.
8. CHUYÊN ĐỀ 8: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG DỊ ỨNG - MIỄN DỊCH
8.1 Cơ chế Phân tử Bệnh lý Miễn dịch và Suy giảm Miễn dịch
FHLH (Hội chứng Thực bào Máu Di truyền)
├── FHLH2: Đột biến gen PRF1 ────> Thiếu hụt Perforin
├── FHLH3: Đột biến gen UNC13D ──> Rối loạn phóng hạt độc tế bào (Munc13-4)
├── FHLH4: Đột biến gen STX11 ───> Rối loạn gắn/dung hợp hạt độc
└── FHLH5: Đột biến gen STXBP2 ──> Rối loạn dung hợp hạt độc
Phổ đột biến FHLH và Chi tiết Thực nghiệm tại Việt Nam (Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu et al.):
FHLH2 (Gen PRF1): Mã hóa Perforin. Đột biến gây mất hoàn toàn hoạt tính perforin, khiến bệnh khởi phát rất sớm ở trẻ sơ sinh.
FHLH3 (Gen UNC13D / Munc13-4): Rối loạn giải phóng hạt độc tế bào.
ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ TẠI VIỆT NAM: Nghiên cứu phân tích phổ đột biến ở bệnh nhân FHLH Việt Nam phát hiện biến thể cắt nối mới (novel splicing variant) c.3151G>A (p.F985fsX14) trên gen UNC13D xuất hiện tái diễn ở 8 bệnh nhân không có quan hệ huyết thống, chiếm tỷ lệ cao nhất trong các đột biến FHLH3 tại Việt Nam.
FHLH4 (Gen STX11) & FHLH5 (Gen STXBP2): Ảnh hưởng đến sự dung hợp hạt độc vào màng tế bào.
Bệnh Agammaglobulinemia liên kết X (XLA): Đột biến gen BTK (Bruton Tyrosine Kinase) làm ngưng trệ sự phát triển dòng tế bào lympho B từ pre-B thành B trưởng thành, dẫn đến thiếu hụt hoàn toàn kháng thể trong máu.
9. CHUYÊN ĐỀ 9: SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ NHIỄM TRÙNG
9.1 Ứng dụng Chẩn đoán Phân tử Tác nhân Nhiễm trùng và Gen Kháng thuốc
Các Kỹ thuật Chẩn đoán Phân tử Vi sinh:
PCR và Real-time PCR: Tiêu chuẩn vàng phát hiện nhanh, định danh chính xác các tác nhân vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng khó nuôi cấy hoặc có mật độ thấp.
dPCR (Digital PCR): Cho phép định lượng tuyệt đối mật độ vi sinh vật mà không phụ thuộc vào đường chuẩn.
Giải trình tự NGS: Tầm soát toàn bộ hệ vi sinh vật (Microbiome) và định danh nhanh các biến chủng đột biến mới.
Định lượng Tải lượng Virus (Viral Load Monitoring): Định lượng ADN/ARN của virus Viêm gan B (HBV), Viêm gan C (HCV), HIV trong huyết thanh bằng Real-time PCR. Đây là chỉ định bắt buộc để đánh giá khởi đầu điều trị, theo dõi mức độ đáp ứng thuốc chống virus và phát hiện sớm hiện tượng thất bại điều trị / kháng thuốc.
Phát hiện Gen Kháng thuốc và Nguy cơ Ung thư:
Xác định các đột biến điểm quy định tính kháng thuốc kháng sinh / kháng virus của vi sinh vật.
Ví dụ lâm sàng: Đột biến vùng Precore / Core Promoter của Virus Viêm gan B (HBV) không chỉ gây mất kháng nguyên HBeAg mà còn làm tăng đáng kể nguy cơ tiến triển thành Ung thư tế bào gan (HCC).
